细菌内毒素检查

　　在细菌内毒素检查方法的建立中，计算内毒素限值L、MVD和MVC时，需要注意最大人用剂量、产品规格、鲎试剂的灵敏度等重要的参数，因为计算错误会导致后续的所有努力均告失败。常见的问题有：(1)临床用药剂量确定不正确，仅用常规用药剂量，未考虑临床可能的人体最大用药剂量和给药途径，在限值计算公式L=K/M中，由于对K值及M值的定义模糊，使K值及M值赋值不准确，最终导致限值计算错误。例如，某注射剂临床成人每次静脉滴注给药40～80mg，婴儿(三个月以上)静脉滴注给药每次10～20mg。按成人(体重60kg)剂量计算限值为3.75EU/mg，而婴儿体重仅为5kg左右，计算限值约为1.25EU/mg，如果不考虑临床每公斤体重最大用药剂量，细菌内毒素限值就会出现较大的差别。(2)有的申报品种细菌内毒素限值不是根据临床用量计算出来，而是根据同品种热原检查的剂量推算出来的，造成限值错误。(3)有的品种细菌内毒素限值从国外药典抄来，没有考虑该品种国内上市的临床使用剂量及中国人与国外人均体重等的差异，也造成限值确定不正确。(4)错误的计算日给药剂量(一日内多次给药)。(5)在品种规格(浓度)发生变化时，计算MVD没有进行调整。(6)建立方法时所用的最大给药剂量已经超出了临床所用剂量等。

细菌内毒素检查法是判断供试品中细菌内毒素是否符合规定。

（1）细菌内毒素标准品为基准物进行标定，确定基重量的相当效价。每1mg工作标准品效价应不小于2EU，不大于50EU，并具备均一性和稳定性的实验数据。效价测定方法如下：每批工作标准品至少取4支样品，使用同一批号鲎试剂、同1支标准品。每支工作标准品按重量、标准品按单位，分别用内毒素检查用水稀释制备一系列2倍稀释度的内毒素溶液，与鲎试剂反应，当4支工作标准品的反应终点的对数均值的标准差(S)小于0.365时，计算4支工作标准品的反应终点的几何平均值(以ng/mg表示)及标准品的反应终点值以(以EU/mg表示)，按下式计算。　

（2）试验准备 本法所用的器皿需经处理，除去可能存在的外源性内毒素常用250℃干烤30分钟或180℃干烤2小时，也可用其他适宜方法。试验操作过程应防止微生物的污染。　试验前需核对使用批号鲎试剂的灵敏度标示值，应符合规定。装量加入配带的鲎试剂溶剂。溶解后，为鲎试剂溶液，备用。　供试品的稀释：使用批号鲎试剂的灵敏度标示值小于供试品的内毒限量时，按下式计算，用内毒素检查用水将供试剂品稀释后进行检查。　供试品的稀释倍数=X/λ　X：供试品的内毒素限量内毒素限量(EU/ml)　λ：供试品鲎度剂灵敏度标示值(EU/ml)　（3）检查装有0.1ml鲎试剂溶液的10×75mm试管(或0.1ml/支规格的鲎试剂原安瓿)4支，其中2支加入0.1ml供试品作为试品管，1支加入2λ内毒素工作标准品0.1ml作为阳性对照管，1支加入配带的鲎试剂溶液0.1ml作为阴性对照管。将试管轻轻混匀后，封闭管口，垂直放入37±1℃水浴中，保温60±2分钟。保温过程和拿取试管要小心，避免因受到振动造成阴性结果。　

（4）结果判断 将试管从水浴中轻轻取出，缓缓倒转1800时，管内凝胶不变形，不从管壁滑脱者为阳性记录为(+)凝胶不能保持完整并从管壁滑脱者为阴性，记录为(-)。供试品2管如为(-)，应认为符合规定，不再进行热原检查法(家兔法)试验。如2管均为(+)，应认为不符合规定。如2管中1管为(+)，1管为(-)，按述方法另取4支供试品管复试，4管中有1管为(+)即认为不符合规定。除正文另有规定外，有符合规定的供试品应再以热原检查法(家兔法)试验，并根据的结果判定。　供试品细菌内毒素的限量应符合各品种正文下的规定。　阳性对照为(-)或阴性对照为(+)，试验无效。