逆转录-聚合酶链反应

(别名:RT-PCR)

  逆转录-聚合酶链反应 (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)的原理是:提取组织或细胞中的总RNA,以其中的mRNA作为模板,采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增,而获得目的基因或检测基因表达。

...[详细][收起]
目录:
基本信息 注意事项 检查作用 检查过程
  • 检查部位: 其他
  • 科室: 免疫学检验  血 
  • 空腹检查:
  • 医院参考价: ¥236-¥315查看详细>>

逆转录-聚合酶链反应注意事项

  1.在实验过程中要防止RNA的降解,保持RNA的完整性。在总RNA的提取过程中,注意避免mRNA的断裂。

  2.为了防止非特异性扩增,必须设阴性对照。

  3.内参的设定:主要为了用于靶RNA的定量。常用的内参有G3PD(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)、β-Actin(β-肌动蛋白)等。其目的在于避免RNA定量误差、加样误差以及各PCR反应体系中扩增效率不均一各孔间的温度差等所造成的误差。

  4.PCR不能进入平台期,出现平台效应与所扩增的目的基因的长度、序列、二级结构以及目标DNA起始的数量有关。故对于每一个目标序列出现平台效应的循环数,均应通过单独实验来确定。

  5.防止DNA的污染:

  (1)采用DNA酶处理RNA样品。

  (2)在可能的情况下,将PCR引物置于基因的不同外显子,以消除基因和mRNA的共线性。

逆转录-聚合酶链反应检查作用

RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级,使一些极为微量RNA样品分析成为可能。该技术主要用于:分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。

逆转录-聚合酶链反应检查过程

1. 总RNA的提取:见相关内容。  

2. cDNA第一链的合成:目前试剂公司有多种cDNA第一链试剂盒出售,其原理基本相同,但操作步骤不一。现以GIBICOL公司提供的SuperScript Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis 试剂盒为例。  

(1)在0.5ml微量离心管中,加入总RNA 1-5μg,补充适量的DEPC H2O使总体积达11μl。在管中加10μM Oligo(dT)12-18 1μl,轻轻混匀、离心。  

(2)70℃加热10min,立即将微量离心管插入冰浴中至少1min。  然后加入下列试剂的混合物:  

10×PCR buffer 2μl  

25mM MgCl2 2μl  

10mM dNTPmix 1μl  

0.1M DTT 2μl  轻轻混匀,离心。

42℃孵育2-5min。  

(3)加入SuperscriptⅡ1μl ,在42℃水浴中孵育50min。  

(4)于70℃加热15min以终止反应。  

(5)将管插入冰中,加入RNase H 1μl ,37℃孵育20min,降解残留的RNA。-20℃保存备用。  

3.PCR:  

(1)取0.5ml PCR管,依次加入下列试剂:  第一链cDNA 2μl  上游引物(10pM) 2μl  下游引物(10pM) 2μl  dNTP(2mM) 4μl  

10×PCR buffer 5μl  Taq 酶(2u/μl) 1μl  

(2) 加入适量的ddH2O,使总体积达50μl。轻轻混匀,离心。  

(3) 设定PCR程序。在适当的温度参数下扩增28-32个循环。为了保证实验结果的可靠与准确,可在PCR扩增目的基因时,加入一对内参(如G3PD)的特异性引物,同时扩增内参DNA,作为对照。  

(4) 电泳鉴定:行琼脂糖凝胶电泳,紫外灯下观察结果。  

(5) 密度扫描、结果分析:采用凝胶图像分析系统,对电泳条带进行密度扫描。