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核糖核酸

RNA,核糖核酸的缩写,即Ribonucleic Acid)的缩写,存在于生物细胞以及部分病毒、类病毒中的遗传信息载体。由至少几十个核糖核苷酸通过磷酸二酯键连接而成的一类核酸,因含核糖而得名,简称RNA。RNA普遍存在于动物、植物、微生物及某些病毒和噬菌体内。RNA和蛋白质生物合成有密切的关系。在RNA病毒和噬菌体内,RNA是遗传信息的载体。RNA一般是单链线形分子;也有双链的如呼肠孤病毒RNA;环状单链的如类病毒RNA;1983年还发现了有支链的RNA分子。

中文名: 核糖核酸
英文名: RNA
部位: 其他

1.核糖核酸RNA-简介

(缩写为RNA,即Ribonucleic Acid),存在于生物细胞以及部分病毒、类病毒中的遗传信息载体。

RNA由核糖核苷酸经磷酯键缩合而成长链状分子。一个核糖核苷酸分子由磷酸,核糖和碱基构成。RNA的碱基主要有4种,即A腺嘌呤,G鸟嘌呤,C胞嘧啶,U尿嘧啶。其中,U(尿嘧啶)取代了DNA中的T胸腺嘧啶而成为RNA的特征碱基。

与DNA不同,RNA一般为单链长分子,不形成双螺旋结构,但是很多RNA也需要通过碱基配对原则形成一定的二级结构乃至三级结构来行使生物学功能。RNA的碱基配对规则基本和DNA相同,不过除了A-U、G-C配对外,G-U也可以配对。

在细胞中,根据结构功能的不同,RNA主要分三类,即tRNA(转运RNA), rRNA(核糖体RNA), mRNA(信使RNA)。mRNA是合成蛋白质的模板,内容按照细胞核中的DNA所转录;tRNA是mRNA上碱基序列(即遗传密码子)的识别者和氨基酸的转运者;rRNA是组成核糖体的组分,是蛋白质合成的工作场所。

在病毒方面,很多病毒只以RNA作为其唯一的遗传信息载体(有别于细胞生物普遍用双链DNA作载体)。

1982年以来,研究表明,不少RNA,如I、II型内含子,RNAse P,HDV,核糖体大亚基RNA等等有催化生化反应过程的活性,即具有酶的活性,这类RNA被称为核酶(ribozyme)。

20世纪90年代以来,又发现了RNAi(RNA interference,RNA干扰)等等现象,证明RNA在基因表达调控中起到重要作用。

在RNA病毒中,RNA是遗传物质,植物病毒总是含RNA。近些年在植物中陆续发现一些比病毒还小得多的浸染性致病因子,叫做类病毒。类病毒是不含蛋白质的闭环单链RNA分子,此外,真核细胞中还有两类RNA,即不均一核RNA(hnRNA)和小核RNA(snRNA)。hnRNA是mRNA的前体;snRNA参与hnRNA的剪接(一种加工过程)。自1965年酵母丙氨酸tRNA的碱基序列确定以后,RNA序列测定方法不断得到改进。目前除多种tRNA、5SrRNA、5.8SrRNA等较小的RNA外,尚有一些病毒RNA、mRNA及较大RNA的一级结构测定已完成,如噬菌体MS2RNA含3569个核苷酸。

核糖核酸

Ribonucleic Acid (RNA)

本品能促进肝细胞蛋白质合成,改善氨基酸代谢,降低血清谷丙转氨酶,改善肝炎患者血清蛋白电泳,并能调节人体免疫功能,促使病变肝细胞恢复正常。临床用于急慢性肝炎肝硬化的治疗。肌内注射,6mg/次,以生理盐水稀释,隔日1次,3个月为1疗程。

2.核糖核酸RNA-结构分析

1965年R.W.霍利等测定了第 1个核酸──酵母丙氨酸转移核糖核酸的一级结构即核苷酸的排列顺序。此后,RNA一级结构的测定有了迅速的发展。到1983年,不同来源和接受不同氨基酸的tRNA已经弄清楚一级结构的超过280种,5S RNA 175种,5.8S RNA也有几十种,以及许多16S rRNA、18S rRNA、23S rRNA和26S rRNA。在mRNA中,如哺乳类珠蛋白mRNA、鸡卵清蛋白mRNA和许多蛋白质激素和酶的mRNA等也弄清楚了。此外还测定了一些小分子RNA如sn RNA和病毒感染后产生的RNA的核苷酸排列顺序。类病毒RNA也有5种已知其一级结构,都是环状单链。MJS2RNA、烟草花叶病毒 RNA、小儿麻痹症病毒RNA是已知结构中比较大的RNA。

除一级结构外,RNA分子中还有以氢键联接碱基(A对U;G对C)形成的二级结构。RNA的三级结构,其中研究得最清楚的是tRNA,1974年用X射线衍射研究酵母苯丙氨酸tRNA的晶体,已确定它的立体结构呈倒L形(见转移核糖核酸)。

RNA 一级结构的测定常利用一些具有碱基专一性的工具酶,将RNA降解成寡核苷酸,然后根据两种(或更多)不同工具酶交叉分解的结果,测出重叠部分,来决定RNA的一级结构。举例如下:

AGUCGGUAG

核糖核酸酶 高峰淀粉酶核糖核酸酶T1

(RNAse A) (RNAse T1)

AGU+C+GGU+AG AG+UCG+G+UAG

牛胰核糖核酸酶是一个内切核酸酶,专一地切在嘧啶核苷酸的3′-磷酸和其相邻核苷酸的5′-羟基之间,所以用它来分解上述AGUCGGUAG9核苷酸,得到AGU、C、GGU和AG4个产物。而核糖核酸酶 T1是一个专一地切在鸟苷酸的3′-磷酸和其相邻核苷酸的5′-羟基之间的内切核酸酶,它作用于上述9核苷酸,则得到AG、UCG、G和UAG4个产物。根据产物的性质,就可以排列出9核苷酸的一级结构。

除上述两种核糖核酸酶外,还有黑粉菌核糖核酸酶(RNAse U2),专一地切在腺苷酸和鸟苷酸处,和高峰淀粉酶核糖核酸酶T1联合使用,可以测定腺苷酸在RNA中的位置。多头绒孢菌核糖核酸酶(RNAse Phy)除了CpN以外的二核苷酸都能较快地水解,因此和牛胰核糖核酸酶合用可以区别Cp和Up在RNA中的位置。

生物功能和种类 20世纪40年代,人们从细胞化学和紫外光细胞光谱法观察到凡是 RNA含量丰富的组织中蛋白质的含量也较多,就推测RNA和蛋白质生物合成有关。RNA 参与蛋白质生物合成过程的有 3类:转运核糖核酸(tRNA)、信使核糖核酸(mRNA)和核糖体核糖核酸(rRNA)。

3.核糖核酸RNA-详细功能

不同的RNA 有着不同的功能 ,其中rRNA是核糖体的组成成分,由细胞核中的核仁合成,而mRNA tRNA 在蛋白质合成的不同阶段分别执行着不同功能。

mRNA是以DNA的一条链为模板,以碱基互补配对原则,转录而形成的一条单链,主要功能是实现遗传信息在蛋白质上的表达,是遗传信息传递过程中的桥梁

tRNA的功能是携带符合要求的氨基酸,以连接成肽链,再经过加工形成蛋白质

具体请参阅高中生物第二册,遗传部分

RNA指 ribonucleic acid 核糖核酸

核糖核苷酸聚合而成的没有分支的长链。分子量比DNA小,但在大多数细胞中比DNA丰富。RNA主要有3类,即信使RNA(mRNA),核糖体RNA(rRNA)和转运RNA(tRNA)。这3类RNA分子都是单链,但具有不同的分子量、结构和功能。

在RNA病毒中,RNA是遗传物质,植物病毒总是含RNA。近些年在植物中陆续发现一些比病毒还小得多的浸染性致病因子,叫做类病毒。类病毒是不含蛋白质的闭环单链RNA分子,此外,真核细胞中还有两类RNA,即不均一核RNA(hnRNA)和小核RNA(snRNA)。hnRNA是mRNA的前体;snRNA参与hnRNA的剪接(一种加工过程)。自1965年酵母丙氨酸tRNA的碱基序列确定以后,RNA序列测定方法不断得到改进。目前除多种tRNA、5SrRNA、5.8SrRNA等较小的RNA外,尚有一些病毒RNA、mRNA及较大RNA的一级结构测定已完成,如噬菌体MS2RNA含3569个核苷酸。

4.核糖核酸RNA-种类

在生物体内发现主要有三种不同的RNA分子在基因的表达过程中起重要的作用。它们是信使RNA(messengerRNA,mRNA)、转运RNA(tranfer RNA,tRNA)、核糖体RNA(ribosomal RNA,rRNA)。RNA含有四种基本碱基,即A腺嘌呤、G鸟嘌呤、C胞嘧啶和U尿嘧啶。此外还有几十种稀有碱基。

RNA的一级结构主要是由AMP、GMP、CMP和UMP四种核糖核苷酸通过3',5'磷酸二酯键相连而成的多聚核苷酸链。天然RNA的二级结构,一般并不像DNA那样都是双螺旋结构,只有在许多区段可发生自身回折,使部分A-U、G-C碱基配对,从而形成短的不规则的螺旋区。不配对的碱基区膨出形成环,被排斥在双螺旋之外。RNA中双螺旋结构的稳定因素,也主要是碱基的堆砌力,其次才是氢键。每一段双螺旋区至少需要4~6对碱基对才能保持稳定。在不同的RNA中,双螺旋区所占比例不同。【RNA的二级结构】细胞内有三类主要的核糖核酸,即:mRNA、rRNA、tRNA。它们各有特点。在大多数细胞中RNA的含量比DNA多5~8倍。【大肠杆菌RNA的性质】

mRNA

生物的遗传信息主要贮存于DNA的碱基序列中,但DNA并不直接决定蛋白质的合成。而在真核细胞中,DNA主要贮存于细胞核中的染色体上,而蛋白质的合成场所存在于细胞质中的核糖体上,因此需要有一种中介物质,才能把DNA 上控制蛋白质合成的遗传信息传递给核糖体。现已证明,这种中介物质是一种特殊的RNA。这种RNA起着传递遗传信息的作用,因而称为信使RNA(messenger RNA,mRNA)。

mRNA的功能就是把DNA上的遗传信息精确无误地转录下来,然后再由mRNA的碱基顺序决定蛋白质的氨基酸顺序,完成基因表达过程中的遗传信息传递过程。在真核生物中,转录形成的前体RNA中含有大量非编码序列,大约只有25%序列经加工成为mRNA,最后翻译为蛋白质。因为这种未经加工的前体mRNA(pre-mRNA)在分子大小上差别很大,所以通常称为不均一核RNA(heterogeneous nuclear RNA,hnRNA)。

tRNA

如果说mRNA是合成蛋白质的蓝图,则核糖体是合成蛋白质的工厂。但是,合成蛋白质的原材料——20种氨基酸与mRNA的碱基之间缺乏特殊的亲和力。因此,必须用一种特殊的RNA——转运RNA(transfer RNA,tRNA)把氨基酸搬运到核糖体上,tRNA能根据mRNA的遗传密码依次准确地将它携带的氨基酸连结起来形成多肽链。每种氨基酸可与1-4种tRNA相结合,现在已知的tRNA的种类在40 种以上。

tRNA是分子最小的RNA,其分子量平均约为27000(25000-30000),由70到90个核苷酸组成。而且具有稀有碱基的特点,稀有碱基除假尿嘧啶核苷与次黄嘌呤核苷外,主要是甲基化了的嘌呤和嘧啶。这类稀有碱基一般是在转录后,经过特殊的修饰而成的。

1969年以来,研究了来自各种不同生物,:如酵母、大肠杆菌、小麦、鼠等十几种tRNA的结构,证明它们的碱基序列都能折叠成三叶草形二级结构(图3-23),而且都具有如下的共性:

① 5’末端具有G(大部分)或C。

② 3’末端都以ACC的顺序终结。

③ 有一个富有鸟嘌呤的环。

④ 有一个反密码子环,在这一环的顶端有三个暴露的碱基,称为反密码子(anticodon).反密码子可以与mRNA链上互补的密码子配对。

⑤ 有一个胸腺嘧啶环。

rRNA

核糖体RNA(ribosomal RNA,rRNA)是组成核糖体的主要成分。核糖体是合成蛋白质的工厂。在大肠杆菌中,rRNA量占细胞总RNA量的75%-85%,而tRNA占15%,mRNA仅占3-5%。

rRNA一般与核糖体蛋白质结合在一起,形成核糖体(ribosome),如果把rRNA从核糖体上除掉,核糖体的结构就会发生塌陷。原核生物的核糖体所含的rRNA有5S、16S及23S三种。S为沉降系数(sedimentation coefficient),当用超速离心测定一个粒子的沉淀速度时,此速度与粒子的大小直径成比例。5S含有120个核苷酸,16S含有1540个核苷酸,而23S含有2900个核苷酸。而真核生物有4种rRNA,它们分子大小分别是5S、5.8S、18S和28S,分别具有大约120、160、1900和4700个核苷酸。

rRNA是单链,它包含不等量的A与U、G与C,但是有广泛的双链区域。在双链区,碱基因氢键相连,表现为发夹式螺旋。

rRNA在蛋白质合成中的功能尚未完全明了。但16 S的rRNA3’端有一段核苷酸序列与mRNA的前导序列是互补的,这可能有助于mRNA与核糖体的结合。

snRNA

除了上述三种主要的RNA外,细胞内还有小核RNA(small nuclearRNA,snRNA)。它是真核生物转录后加工过程中RNA剪接体(spilceosome)的主要成分。现在发现有五种snRNA,其长度在哺乳动物中约为100-215个核苷酸。snRNA一直存在于细胞核中,与40种左右的核内蛋白质共同组成RNA剪接体,在RNA转录后加工中起重要作用。另外,还有端体酶RNA(telomeraseRNA),它与染色体末端的复制有关;以及反义RNA(antisenseRNA),它参与基因表达的调控。

有的RNA分子还具有生物催化作用。

上述各种RNA分子均为转录的产物,mRNA最后翻译为蛋白质,而rRNA、tRNA及snRNA等并不携带翻译为蛋白质的信息,其终产物就是RNA。

2006诺贝尔医学奖成果RNA干扰机制解读

1990年,曾有科学家给矮牵牛花插入一种催生红色素的基因,希望能够让花朵更鲜艳。但意想不到的事发生了:矮牵牛花完全褪色,花瓣变成了白色!科学界对此感到极度困惑。

类似的谜团,直到美国科学家安德鲁·法尔和克雷格·梅洛发现RNA(核糖核酸)干扰机制才得到科学的解释。两位科学家也正是因为1998年做出的这一发现而荣获今年的诺贝尔生理学或医学奖。

根据法尔和梅洛的发现,科学家在矮牵牛花实验中所观察到的奇怪现象,其实是因为生物体内某种特定基因“沉默”了。导致基因“沉默”的机制就是RNA干扰机制。

此前,RNA分子只是被当作从DNA(氧核糖核酸)到蛋白质的“中间人”、将遗传信息从“蓝图”传到“工人”手中的“信使”。但法尔和梅洛的研究让人们认识到,RNA作用不可小视,它可以使特定基因开启、关闭、更活跃或更不活跃,从而影响生物的体型和发育等。

诺贝尔奖评审委员会在评价法尔和梅洛的研究成果时说:“他们的发现能解释许多令人困惑、相互矛盾的实验观察结果,并揭示了控制遗传信息流动的自然机制。这开启了一个新的研究领域。”

科学家认为,RNA干扰技术不仅是研究基因功能的一种强大工具,不久的未来,这种技术也许能用来直接从源头上让致病基因“沉默”,以治疗癌症甚至艾滋病,在农业上也将大有可为。从这个角度来说,“沉默”真的是金。美国哈佛医学院研究人员已用动物实验表明,利用RNA干扰技术可治愈实验鼠的肝炎

目前,尽管尚有一些难题阻碍着RNA干扰技术的发展,但科学界普遍对这一新兴的生物工程技术寄予厚望。这也是诺贝尔奖评审委员会为什么不坚持研究成果要经过数十年实践验证的“惯例”,而破格为法尔和梅洛颁奖的原因之一。

诺贝尔生理学或医学奖评审委员会主席戈兰·汉松说:“我们为一种基本机制的发现颁奖。这种机制已被全世界的科学家证明是正确的,是给它发个诺贝尔奖的时候了。”

5.核糖核酸RNA干扰(RNAi)

RNAi的定义

目前对RNAi (RNA interference)的定义有很多种,不同的资料对其定义的侧重点也不尽相同,如果将RNAi看作一种生物学现象,可以有以下定义:① RNAi是由dsRNA介导的由特定酶参与的特异性基因沉默现象,它在转录水平、转录后水平和翻译水平上阻断基因的表达。② RNAi是有dsRNA参与指导的,以外源和内源mRNA为降解目标的转基因沉默现象。具有核苷酸序列特异性的自我防御机制,是一种当外源基因导入或病毒入侵后,细胞中与转基因或入侵病毒RNA同源的基因发生共同基因沉默的现象。

如果将其作为一门生物技术,则定义为:① RNAi 是指通过反义RNA与正链RNA 形成双链RNA 特异性地抑制靶基因的现象,它通过人为地引入与内源靶基因具有相同序列的双链RNA(有义RNA 和反义RNA) ,从而诱导内源靶基因的mRNA 降解,达到阻止基因表达的目的。② RNAi是指体外人工合成的或体内的双链RNA(dsRNA)在细胞内特异性的将与之同源的 mRNA降解成21nt~23nt 的小片段,使相应的基因沉默。③ RNAi是将与靶基因的mRNA 同源互补的双链RNA(dsRNA ) 导入细胞,能特异性地降解该mRNA ,从而产生相应的功能表型缺失, 属于转录后水平的基因沉默(post - transcriptional gene silence , PTGS)。

各种不同定义虽然说法不同,但所描述事实是大体相同的,简单地可以说,RNAi就是指由RNA介导的基因沉默现象。

最近由于RNA干扰(RNA interference,RNAi)的发现使反义领域的研究增多。这种自然发生的现象最早是在秀丽线虫中发现的(1),是序列特异性地使转录后的基因沉默的有力机制。由于最近两年在RNAi领域取得的进步,已经有许多这方面的综述发表(2-4)。RNA干扰是由长的双链RNA分子发动的,该分子可以被Dicer enzyme加工成长度为21-23个核苷酸的RNA(见图)。RNAseIII蛋白被认为是作为一个二聚体发挥作用,它对双链RNA的两个链都进行切割,酶切的产物3'末端互相重叠。然后这种小的干扰RNA分子(small interfering RNAs,siRNAs)掺入RNA诱导的沉默复合物(RNA-induced silencing complex,RISC),引导核酸酶降解靶RNA。

这种保守的生化机制可用于研究多种模式生物的基因功能,但是它在哺乳动物细胞中的应用受到阻碍,因为长的双链RNA分子会引起干扰素应答。因此Tuschi及其同事表明长度为21nt的siRNA可以特异性的抑制哺乳动物细胞基因表达是一个革命性的突破(5)。这个发现激发了大量利用RNAi技术对哺乳动物细胞的研究,因为与传统的反义技术比,RNAi的性能明显较高。

有趣的是,除了短双链RNA,短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA),比如茎环结构在细胞内经过加工后也可以变成siRNA,从而产生RNA干扰(6、7)。这使得构建表达干扰RNA的载体,从而使哺乳动物细胞内基因表达长期沉默成为可能(4、8)。shRNA可以利用RNA聚核酶III启动子转录,在正常情况下,该启动子是控制小核RNA(small nuclear RNA,snRNA)U6(6、7、9、10)或者RNAseP的组分H1 RNA(11)转录的。另外一种办法是两段短RNA分子分别用U6启动子转录出来(6、12、13)。载体介导的siRNA表达使对功能缺失(loss-of-function)表型进行长期分析成为可能。在稳定转染的细胞内,两个月后仍可观察到沉默现象(11)。

另外一种延长siRNA抑制基因表达时间的方法是对化学合成的RNA进行核苷酸修饰。尽管未经修饰的短双链RNA在细胞培养物或者体内的稳定性出乎意料的高,然而有些情况下,需要对siRNA的稳定性进行进一步提高。因此,可以在两条链的末端都引入经过修饰的核苷(14)。一个5'端为两个2'-O-甲基RNA、3'端为4个甲基化核苷的siRNA与序列相同但是未经修饰的siRNA比活性相同,但是在细胞培养物中引起的基因沉默现象的时间延长。然而,增多siRNA中的甲基化核苷,或者在核苷中引入体积较大的烯丙基将导致siRNA活性下降。

RNA干扰在哺乳动物体内的第一个研究是利用快速注射大量生理溶液的方法将一个编码shRNA的质粒注入老鼠的尾静脉(15、16)。在大多数器官中,报道基因(编码于共转染质粒或者转基因小鼠上)的表达可以被有效地抑制。另外,Fas基因被作为肝损伤治疗相关的内源靶标进行了RNA干扰实验(17)。注射siRNA之后,小鼠肝细胞中的Fas mRNA和蛋白水平下降了10天。把Fas基因沉默可以保护小鼠免遭由注射竞争性Fas特异抗体引起的爆发性肝炎,82%用siRNA处理的小鼠活过了10天观察期,而所有的对照小鼠在3天之内死亡。

上述研究中采用的高压导入技术是一种粗暴的方法,不适于治疗用。因此,标准的基因治疗所采用的方法被用于RNA干扰。一个反转录病毒载体被用于导入siRNA,以抑制人类胰腺肿瘤细胞中的癌基因K-ras等位基因(18)。负调控癌细胞中K-ras基因的表达使得它们在注入无胸腺的裸鼠皮下之后不再具有形成肿瘤的能力。这项研究还表明siRNA的高度特异性,因为只有癌基因K-ras被沉默,而与之只有1个碱基对差异的野生型等位基因并没有被沉默。另外,当在纹状区注射表达siRNA的腺病毒之后,转基因小鼠大脑中GFP基因的表达可以被抑制(19)。β-葡萄糖醛酸苷酶(b-glucoronidase)的活性可以通过在小鼠尾静脉注射重组腺病毒抑制。有趣的是,具有CMV启动子和最小的polyA尾的RNA聚合酶II表达元件被用于这个实验,为设计组织特异性或者可诱导的siRNA载体打开了大门。

总的来说,siRNA的第一个体内实验已经进行,其他有重要意义的基因有望于很快作为靶标开展研究。至今为止的研究没有观察到任何应用siRNA引起的毒性作用,但是在治疗人类疾病的临床试验开始之前仍需小心,以排除长期使用RNA干扰引起的严重副作用。因为用siRNA使基因表达沉默与传统的反义技术相似,研究者将从十多年来反义技术研究的教训中获益,比如需要使用合适的对照以证明基因表达的敲除是特异性的,以及对免疫系统可能引起的意外影响进行详细分析。

总结

经过长期盛衰沉浮,反义技术近年来得到越来越多的注意。对能够提高靶表亲和性和生物稳定性、降低毒性的修饰核苷的研究取得了重要进展。由于大多数新的DNA类似物不能激活RNAseH,对反义寡核苷酸的设计需要考虑靶mRNA是否需要保留,例如,是改变剪接方式,还是降解靶mRNA(这种情况下应该使用gapmer技术)。可以通过有系统的修饰天然核酶或者通过体外选择技术获得具有高催化活性的稳定核酶。一些反义寡核苷酸和核酶已经进入临床试验研究,一个反义药物已经在1998年获得批准。一个重要的突破是发现短的双链RNA分子可用于哺乳动物细胞中特异性沉默基因表达。这个方法与传统的反义技术比效率明显更高,并且一些体内实验的数据已经发表。因此,反义技术有望广泛应用于对未知功能基因的研究、药物靶标的确认和治疗。

miRNAmicroRNAs(miRNAs)是一种小的,类似于siRNA的分子,由高等真核生物基因组编码,miRNA通过和靶基因mRNA碱基配对引导沉默复合体(RISC)降解mRNA或阻碍其翻译。miRNAs在物种进化中相当保守,在植物、动物和真菌中发现的miRNAs只在特定的组织和发育阶段表达,miRNA组织特异性和时序性,决定组织和细胞的功能特异性,表明miRNA在细胞生长和发育过程的调节过程中起多种作用。

miRNA原理

miRNA基因通常是在核内由RNA聚合酶II(polII)转录的,最初产物为大的具有帽子结构(7MGpppG)和多聚腺苷酸尾巴(AAAAA)的pre-miRNA。pre-miRNA在核酸酶Drosha和其辅助因子Pasha的作用下被处理成70个核苷酸组成的pre-miRNA。RAN–GTP和exportin 5将pre-miRNA输送到细胞质中。随后,另一个核酸酶Dicer将其剪切产生约为22个核苷酸长度的miRNA:miRNA*双链。这种双链很快被引导进入沉默复合体(RISC)复合体中,其中一条成熟的单链miRNA保留在这一复合体中。成熟的miRNA结合到与其互补的mRNA的位点通过碱基配对调控基因表达。

与靶mRNA不完全互补的miRNA在蛋白质翻译水平上抑制其表达(哺乳动物中比较普遍)。然而,最近也有证据表明,这些miRNA也有可能影响mRNA的稳定性。使用这种机制的miRNA结合位点通常在mRNA的3’端非翻译区。如果miRNA与靶位点完全互补(或者几乎完全互补),那么这些miRNA的结合往往引起靶mRNA的降解(在植物中比较常见)。通过这种机制作用的miRNAs的结合位点通常都在mRNA的编码区或开放阅读框中。每个miRNA可以有多个靶基因,而几个miRNAs也可以调节同一个基因。这种复杂的调节网络既可以通过一个miRNA来调控多个基因的表达,也可以通过几个miRNAs的组合来精细调控某个基因的表达。随着miRNA调控基因表达的研究的逐步深入,将帮助我们理解高等真核生物的基因组的复杂性和复杂的基因表达调控网络。

目前只有一小部分miRNAs生物学功能得到阐明。这些miRNAs调节了细胞生长,组织分化,因而与生命过程中发育、疾病有关。通过对基因组上miRNA的位点分析,显示其在发育和疾病中起了非常重要的作用。一系列的研究表明:miRNAs在细胞生长和凋亡,血细胞分化,同源异形盒基因调节,神经元的极性,岛素分泌,大脑形态形成,心脏发生,胚胎后期发育等过程中发挥重要作用。例如,miR-273和lys-6编码的miRNA,参与线虫的神经系统发育过程;miR-430参与斑马鱼的大脑发育;miR-181控制哺乳动物血细胞分化为B细胞;miR-375调节哺乳动物胰岛细胞发育和胰岛素分泌;miR-143在脂肪细胞分化起作用;miR-196参与了哺乳动物四肢形成,miR-1与心脏发育有关。另有研究人员发现许多神经系统的miRNAs在大脑皮层培养中受到时序调节,表明其可能控制着区域化的mRNA翻译。对于新的miRNA基因的分析,可能发现新的参与器官形成、胚胎发育和生长的调节因子,促进对癌症等人类疾病发病机制的理解。

miRNA特点:

广泛存在于真核生物中, 是一组不编码蛋白质的短序列RNA , 它本身不具有开放阅读框架(ORF) ;

通常的长度为20~24 nt , 但在3′端可以有1~2 个碱基的长度变化;

成熟的miRNA 5′端有一磷酸基团, 3′端为羟基, 这一特点使它与大多数寡核苷酸和功能RNA 的降解片段区别开来;

多数miRNA 还具有高度保守性、时序性和组织特异性。

6.核糖核酸RNA的提取

一、准备试剂:

氯仿,异丙醇,75℅乙醇,无RNAse的水或0.5℅SDS(溶液均需用DEPC处理过的水配制)。

二、操作步骤:

1. 匀浆处理:

a. 组织 将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10℅。

b. 单层培养细胞 直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞,每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml,用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定,不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。

c. 细胞悬液 离心收集细胞,每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml TRIzol,反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。

2. 将匀浆样品在室温(15-30℃)放置5分钟,使核酸蛋白复合物完全分离。

3. 可选步骤:如样品中含有较多蛋白质,脂肪,多糖或胞外物质(肌肉,植物结节部分等)可于2-8℃10000×g离心10分钟,取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜,多糖,高分子量DNA,上清中含有RNA。处理脂肪组织时,上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿,剧烈振荡15秒,室温放置3分钟。

6. 2-8℃10000×g离心15分钟。样品分为三层:底层为黄色有机相,上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中,水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。

7. 把水相转移到新管中,如要分离DNA和蛋白质可保留有机相,进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇,室温放置10分钟。

8. 2-8℃10000×g离心10分钟,离心前看不出RNA沉淀,离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。

9. 用75℅乙醇洗涤RNA沉淀。每使用1ml TRIzol至少加1ml 75℅乙醇。2-8℃不超过7500×g离心5分钟,弃上清。

10. 室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀,大约晾5-10分钟即可.不要真空离心干燥,过于干燥会导致RNA的溶解性大大降低。加入25-200μl无RNAse的水或0.5℅SDS,用枪头吸打几次,55-60℃放置10分钟使RNA溶解.如RNA用于酶切反应,勿使用SDS溶液。RNA也可用100℅的去离子甲酰胺溶解,-70℃保存。

三、注意事项:

1. 从少量样品(1-10mg组织或102-104细胞)中提取RNA时可加入少许糖原以促进RNA沉淀。例如加800ml TRIzol匀浆样品,沉淀RNA前加5-10μg RNAse-free糖原。糖原会与RNA一同沉淀出来,糖原浓度不高于4mg/ml是不影响第一链的合成,也不影响PCR反应。

2. 匀浆后加氯仿之前样品可以在-60至-70℃保存至少一个月。RNA沉淀可以保存于75% 酒精中2-8℃一星期以上或-5至-20℃一年以上。

3. 分层和RNA沉淀时也可使用台式离心机,2600×g离心30-60分钟。

预期产量:1mg组织或1×106细胞提取RNA分别为:

肝和6-10μg ,肾3-4μg ,骨骼肌和脑组织1-1.5μg ,胎盘1-4μg ,上皮细胞8-15μg ,成纤维细胞5-7μg 。

四、常见问题分析:

1. 得率低:

A. 样品裂解或匀浆处理不彻底

B. RNA沉淀未完全溶解

2. A260/A280<1.65 :

A. 检测吸光度时,RNA样品没有溶于水,而溶于了TE中。低离子浓度和低pH值条件下A280值偏高

B. 样品匀浆时加的试剂量太少

C. 匀浆样品时未在室温放置5分钟

D. 吸取水相时混入了有机相

E. RNA沉淀未完全溶解。

3. RNA降解:

A. 组织取出后没有马上处理或冷冻

B. 待提取RNA的样品没有保存于-60至-70℃,而保存在了-5至-20℃

C. 细胞在用酶处理时过度

D. 溶液或离心管未经RNAse去除处理

E. 电泳时使用的甲醛pH值低于了3.5

4. DNA污染:

A. 样品匀浆时加的试剂量太少

B. 样品中含有有机溶剂(如乙醇,DMSO等),强缓冲液或碱性溶液

5. 蛋白聚糖和多糖污染:

沉淀RNA的过程中作以下改进可去除这些污染,步骤7中,每使用1ml TRIzol在水相中加0.25ml异丙醇和0.25ml高盐溶液(0.8M柠檬酸钠和1.2M NaCl)混合离心,按之前操作进行。这种方法可使蛋白聚糖和多糖留在溶液中,高效沉淀出纯RNA。从含有大量多糖的植物中提取RNA时应在匀浆后离心,并加上以上操作步骤。

7.核糖核酸相关疾病

胰腺癌 肝癌 胃癌 肺癌 乳腺癌
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