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乙型肝炎病毒核苷(酸)类似物耐药变异

2016-05-17 00:00:00闫杰闫杰
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核心提示:核苷(酸)类似物与HBV DNA聚合酶的自然底物——三磷酸脱氧核苷(dNTP)竞争性的同该酶结合,从而使HBV DNA合成终止,达到抑制HBV复制的目的;因此与HBV DNA聚合酶结合能力的强弱决定了该类药物的疗效。

闫杰肝病中心 副主任医师
查看名医介绍收起名医介绍首都医科大学附属北京地坛医院
名医介绍:具有扎实的医学理论知识和丰富的临床工作经验,熟练掌握各种肝病的临床诊疗工作;擅长慢性乙型肝炎、慢性丙性肝炎抗病毒治疗,对乙型肝炎核苷(酸)类似物耐药变异的临床诊治进行广泛研究。共主持相关科研课题4项,参研课题10余项,发表学术论文40余篇,申报发明专利1项,主编专业论著1部(人民卫生出版社:内科疑难病例—感染病与肝病分册),参编专业论著5部。

第一节         HBV耐药变异的发生机制

核苷(酸)类似物与HBV DNA聚合酶的自然底物——三磷酸脱氧核苷(dNTP)竞争性的同该酶结合,从而使HBV DNA合成终止,达到抑制HBV复制的目的;因此与HBV DNA聚合酶结合能力的强弱决定了该类药物的疗效。当HBV DNA聚合酶氨基酸序列(一级结构)所发生的改变足以影响其空间构像(三级结构),从而导致该酶同核苷(酸)类似物结合能力明显降低时,便发生了耐药现象。例如YMDD变异导致拉米夫定耐药的主要机制就是由于rt204位的蛋氨酸被缬氨酸或异亮氨酸替代后,使此侧链缩短,拉米夫定结合位点变大,不再适合同拉米夫定结合,而此时同自然底物dCTP的结合力却大大提高,导致拉米夫定耐药变异出现。

同其他物种相比, HBV复制能力很强,每24小时可以复制1012~13个拷贝,在复制的逆转录过程中,由于逆转录酶缺乏严格校正机制,自发突变率高达10-5;因此在慢性HBV感染患者体内积累了大量的基因序列突变的HBV病毒株。从准种特点来看,任何CHB患者血液中的HBV都是以不同种群存在的,种群的性质和特点,主要取决于病毒群不同组分的复制能力和机体的免疫力之间相互作用最终达到的一种平衡的结果。当应用核苷(酸)类似物抗病毒治疗时,这种平衡即被打破,在药物的选择压力下,形成了新的平衡,各种病毒种群所占的相对比率也进行了新的调整。优势种群和不同的劣势种群之间的这种转换,称之为种群的的漂变(shift)。如果有些病毒的基因变异恰好位于HBV DNA聚合酶的区域,且能够影响该酶同核苷(酸)类似物结合能力,就会产生耐药。以前认为,突变病毒株复制能力比野生型病毒复制能力有下降,但是目前认为HBV DNA突变对于病毒复制能力的影响是多种多样的:或降低其复制能力,或提高其复制能力,或没有影响。在没有核苷(酸)类似物抗病毒治疗的时候,各病毒株在病毒群中所占的比例,主要由其复制能力的强弱所决定;而抗病毒治疗时,各病毒株对药物敏感性的不同将会影响其在病毒群中的相对比例。对于核苷(酸)类似物敏感的病毒株,在病毒群中的绝对数和相对比例会逐渐减少,而耐药病毒株的绝对数可能变化不大,但其相对比率会逐渐上升。因此,经过抗病毒药物的选择,最终耐药病毒株从劣势种群逐渐演变成优势种群。从某种意义上讲,HBV耐药变异现象的发生机制是达尔文进化论的又一个完美例证。

耐药研究中还提出了基因屏障(genetic barrier)和药代动力学屏障(pharmacodynamic barrier)的学说。所谓基因屏障是指:只出现一个位点的基因变异就产生耐药的药物(如LAM)比同时出现多个位点突变才产生耐药的药物(如ETV)更容易发生耐药现象。所谓药代动力学屏障是指:治疗过程中选择出变异株的几率主要取决于药物抑制病毒复制的强度。抗病毒作用较弱的药物未对HBV施加明显的选择压力,产生耐药的几率也不高(如ADV)。相反如果药物能够完全抑制病毒复制,那么随着HBV复制的明显减弱,其自发突变也将大大减少,故而产生耐药的几率也会减小(如ETV)。而单用一种中等强度的抗病毒药物治疗时,耐药变异将会大大增强(如LAM)。药代动力学屏障的另外一层含义是:治疗早期抑制病毒复制的能力越强,产生耐药变异的几率就越小。也就是说,核苷(酸)类似物抑制病毒复制的作用越强、越快,产生耐药的机会就越小。

当然,这些因素不是产生耐药的全部决定因素,CHB患者临床耐药的产生是由病毒、机体免疫力、药物作用的特点等综合因素来决定的,诸因素间的相互关系尚待进一步阐明。

第二节         HBV耐药变异的相关概念及变异位点的命名方法

随着核苷(酸)类似物的广泛应用,为了便于学术交流,学术界就HBV耐药变异的相关概念和变异位点的命名方法进行了规范。

一、相关概念

(一)基因型耐药(genotypic resistance

    指乙肝病毒基因(通常位于聚合酶基因)出现某种特定的变异,这些变异点已通过体内外实验证实与耐药密切相关。

(二)表型耐药(phenotypic resistance

    表型耐药指在体外药敏检测系统中,病毒毒株对药物的敏感性明显下降,通过用IC50或EC50来表示,可通过细胞培养系统、动物模型等方法来检测。通常的实验流程是:在CHB患者血中检测到了耐药相关的基因突变,把变异的HBV DNA实现全基因克隆化,构建真核表达载体,体外转染肝癌细胞系,进行相应核苷(酸)类似物的EC50/IC50的测定,如与野生株相比克隆的病毒株对药物的敏感性降低4倍以上,可确定为表型耐药。由此可知,表型耐药是对体外试验结果的一种描述。

(三)病毒学耐药 (virological resistance

    出现某种特定的关键耐药变异,同时有病毒定量反跳大于一个log10拷贝/毫升或治疗中HBV DNA从“测不到”上升至检测限以上;亦称之为HBV DNA的反弹(rebound)或突破(breakthrough)。

(四)临床耐药(clinical resistance

出现特定的关键基因型耐药变异,同时有病毒学耐药和ALT反跳称为临床耐药。ALT水平从正常值上限显著上升、或者在原来基础上出现显著升高,称为ALT波动(flare),这是由于病毒复制水平增加,导致肝脏炎症活动,从而引起血清ALT水平升高。临床恶化(deterioration or exacerbation)是CHB患者因为病毒复制和肝脏炎症加剧,导致临床症状和体征的恶化。

(五)交叉耐药(cross resistance

   针对一种药物的耐药基因突变,对于另外一种尚未应用的药物也出现耐药现象,称为交叉耐药。交叉耐药产生的结构基础是相关药物耐药基因位点的接近或重叠。

二、变异位点的命名方法

    已知核苷(酸)类似物耐药变异均发生在HBV 聚合酶基因(pol)上。HBV pol可分为4个功能区:终端蛋白(terminal protein) 、间隔区(spacer) 、逆转录酶区(reverse transcriptase, RT) 及RNA降解酶区(RNase H)。RT区包含7个功能保守序列(A-G), 其中A、C、D区为逆转录酶与三磷酸核苷结合的结合域,B、E区为RNA模板和引物定位域。目前临床应用的核苷(酸)类似物主要靶点位于逆转录酶RT区的B、C、D区,故而耐药变异亦多位于B、C、D区内(图3)。HBV耐药变异以国际通行的氨基酸单字母加变异位点来标记。例如,YMDD代表RT区的4个氨基酸残基(酪氨酸-蛋氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸),其中的蛋氨酸(M)变为亮氨酸(V)或异亮氨酸(I)则会引起拉米夫定耐药。起初HBV耐药变异的位置是从HBV pol 的第一个氨基酸数起,由于HBV 8个基因型的HBV pol长短不同,以不同HBV基因型为参照,同一耐药变异所处的位点不同。例如YMDD变异曾被报道成M552V、M550V、M539V等不同命名。为避免混乱,Stuyverg等(2001)提议将HBV耐药变异统一从逆转录酶区(各基因型均为344个氨基酸)的第一个氨基酸数起并加前缀rt (例如YMDD变异被命名为rtM204V)。目前,该命名方法已得到学术界的广泛认可。

 

第三节         常见耐药变异位点

一、与拉米夫定(lamivudineLAM)耐药相关的变异

LAM的耐药性与HBV逆转录酶C区的YMDD基序相关。在LAM的治疗过程中,可选择性地出现逆转录酶基因变异,包括C区的rtM204I/V/S伴或不伴B区的rtL180M。治疗前血清中HBV DNA和ALT的高水平及对病毒复制的不完全抑制均可促进LAM耐药的发生。体外试验证实LAM耐药变异可使病毒对其敏感性降低至少100倍,甚至大于1000倍。rtM204I变异可单独发生, 而rtM204V和rtM204S变异的发生常伴有B区或A区的其他变异。rtL180M+ rtM204V、rtL180M + rtM204I、rtV173L + rtL180M +rtM204V、rtM204I是LAM耐药变异的主要组合方式。rtM204V或 rtM204I变异可直接导致对拉米夫定的强耐药性,rtV173L和rtL180M则为两个辅助变异。由于YMDD直接参与HBV 聚合酶的催化反应,rtM204V及rtM204I变异不仅造成对拉米夫定耐药,同时也会降低HBV聚合酶活性。因此,rtM204V及rtM204I变异病毒复制能力较差。在rtM204V或 rtM204I变异基础上,增加rtV173L和rtL180M变异可以提高rtM204V及 rtM204I变异病毒株的复制能力,从而形成更强的生存优势。因此,rtV173L和rtL180M变异经常与YMDD变异同时发生在拉米夫定耐药病毒株上。

LAM治疗伴有较高的耐药发生率,治疗1~5年的耐药率分别为20%、38%、49%、66%、69%。

二、与阿德福韦酯(adefovirADV)耐药相关的变异

ADV耐药与逆转录酶B区rtA181T和D区N236T变异有关。有研究显示,位于C、D间区的rtV214A或rtQ215S及两点的联合变异也与此药耐药相关。HBV的聚合酶基因区变异可使该药的IC50增加3~8倍,并且可导致ADV与TDF出现交叉耐药。引起ADV耐药的rtN236T变异株并不影响病毒对LAM的敏感性,但rtA181T/V、rtV214A、rtQ215S变异株可同时导致LAM的交叉耐药。新近有研究发现:3例出现LAM耐药患者初次应用ADV时即出现临床耐药,但对TDF敏感;测序分析及体外试验证实三者体内均存在rtI233V HBV变异株。其后对GenBank收录的HBV序列分析时发现,500个序列中有3个发生该变异且均为C基因型(我国常见基因型为B型及C型)。

ADV治疗耐药发生率比拉米夫定低。70例HBeAg阴性CHB经ADV治疗5年,第1、2、3、4和5年用测序法检测基因型耐药性分别为0%、3%、11%、18%和29%。ADV单药治疗原有拉米夫定耐药467例的回顾分析显示,仅4例有基因型耐药。ADV和拉米夫定联合应用未发现对ADV的耐药。对114例患者回顾性分析显示,48周治疗后如HBV DNA>1×103拷贝/ml,仅能可预测第3年发生耐药。最近报道应用更灵敏的检测技术测出第1年ADV耐药变异率为5%,第2年增至20%。这些研究提示对拉米夫定耐药者换用ADV单药治疗(不是联合应用)是上述报道中发生较高耐药率的原因。最近报道ADV治疗HBeAg阴性CHB患者185例,可测基因变异率为29%,病毒学耐药20%,ALT反弹11%。

三、与恩替卡韦(entecavirETV)耐药相关的变异

目前研究结果显示,产生ETV耐药性的先决条件是需要有LAM耐药变异(rtM204I/V/S±rtL180M)的存在。在LAM耐药变异株上,rtI169T、rtT184A/G/I/S、rtS202G/I或rtM250V等变异的出现可形成对ETV的耐药性。体外试验显示:在未出现LAM耐药时,rtM250V可使该药的IC50增长9倍,而rtT184G+rtS202I并无耐药性。

恩替卡韦对初治患者(指未用过核苷类抗HBV药物者)很少发生耐药,1~4年的耐药发生率均为<1%。对拉米夫定治疗失败的141例患者中,1年和2年的基因型耐药分别为7%和16%,病毒学反弹为1%和10%,较初治患者明显升高。

四、与替比夫定(telbivudineLdT)耐药相关的变异

体外细胞学实验表明,发生rtM204I变异或者rtL180M/rtM204V双变异的对拉米夫定耐药的HBV对替比夫定抗病毒应答率降低超过1000倍。体外实验还显示,替比夫定对rtM204V变异的HBV仍有效(效果降低1.2倍),表现出中度的抗病毒活性;但目前尚无临床试验证据。在体外实验中,与阿德福韦酯耐药有关的rtA181V变异的病毒对替比夫定的敏感度减低3到5倍;与阿德福韦酯耐药有关的N236T变异的病毒对替比夫定仍然敏感。

在一项Ⅲ期全球登记试验(007 GLOBE study) 中发现430例HBeAg阳性和227例HBeAg阴性CHB患者治疗52周后,分别有59%和89%用PCR法测不出HBV DNA(<300拷贝/ml)。其中分别有145例(34%)和19例(8%)HBV DNA ≥1000拷贝/ml。在治疗≥16周检测基因型耐药出现病毒学失效者,HBeAg阳性患者为49/103,HBeAg阴性患者为12/12。病毒变异包括M204I、L80I/V、A181T、L180M和L229W/V,以M204I最常见(46例中有34例),伴有病毒学反弹(≥1log10拷贝/ml)。用替比夫定治疗2年,HBeAg阳性和阴性患者出现耐药性为21.6%和8.6%。

 

第四节         常用基因型耐药检测技术

随着越来越多的CHB患者接受多种核苷(酸)类似物治疗,交叉耐药、多重耐药的出现使得这类药物的临床应用面临新的挑战,耐药变异的临床监测对于出现耐药变异后进一步抗病毒治疗方案的选择意义重大。本节试就目前常用的HBV耐药变异检测方法的基本原理、优缺点及应用前景作以介绍。

一、位点特异性引物PCR

位点特异性引物仅与特异突变序列结合,可特异地扩增出突变株。但每对引物只能检测一种突变,且反应条件不易控制,存在非特异扩增的可能,因此很难应用于临床检测。

二、聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性( polymerase chain reaction- restriction fragment length polymorphism PCRRFL P)

将待测的DNA片段经PCR扩增后用限制性内切酶酶切,以识别并切割特异的序列,将酶切后的产物进行电泳, 据DNA 片段的大小来判断目的基因是否具有特异性序列。该方法具有灵敏、特异、简便等优点,曾被国内外众多实验室广泛应用于LAM耐药变异检测工作中,我们也建立了基于该技术的ADV耐药变异检测方法。然而PCR-RFL P只能检测单位点突变,仅用于少数耐药变异位点监测时尚不失为一种简便、快速、廉价的方法;但随着多种核苷类药物的相继问世和HBV耐药变异位点的不断出现,该方法便难以胜任了。

三、线性探针(linear probe

将多条探针分别固定在固相杂交膜的不同位置,每条探针用来检测一种突变序列;然后与HBV聚合酶的基因扩增产物杂交。控制反应条件,使不同突变序列与相应探针结合, 据结合的位置不同来判读突变情况。基于该技术的INNO-LiPA方法在国外已获准应用于临床检测。该方法经PCR扩增后杂交,敏感度好,可检测变异株大于10 %的低滴度样品,尚具有提供信息量大、自动化程度高等优点;但试剂价格昂贵,国内尚未获准临床应用许可。

四、肽核酸-PCR ( PNA-PCR)

PNA是一种核酸类似物,它的骨架为肽键链,碱基连在骨架链上的氮原子上。寡聚PNA 可以与单链核酸模板结合,但不能作为引物引导DNA 的合成。寡聚PNA结合力较普通寡核苷酸强,退火温度( Tm) 比普通寡核苷酸高50 %,但如果出现错配,则结合力迅速下降。设计位于PCR引物上游的寡聚PNA作为阻遏物,在模板为野生株时,寡聚PNA与模板完全配对,不能发生PCR反应;当模板为变异株时,寡聚PNA与模板出现错配,结合力迅速下降,失去阻遏作用,使PCR反应得以进行。该方法操作简便,敏感性高,可以从105~109个野生型拷贝中检测到0. 01 %~0. 001 %(10~10 000)突变拷贝,有望成为新的HBV耐药变异检测方法。该方法主要缺点是仅能检测有无耐药变异,不能获得突变部位的基因序列信息。

五、荧光定量PCR熔解曲线分析法

该方法基于Lightcycler或Taqman杂交双探针技术;除常规的一对引物外,PCR反应体系中另加有两个能与PCR产物杂交的荧光标记探针,所设计的探针跨过待检测的已知突变位点。在PCR扩增过程中,通过熔解曲线分析来测定Tm值,最终 据突变株的Tm值低于野生株的Tm值而检测耐药突变的有无。该方法的灵敏度低,且仅能检测单点变异,使其推广受到限制。

六、基因芯片技术

基因芯片( gene chip) 亦称DNA芯片(DNA chip ) 、DNA 微阵列(DNA microarray);其技术路线是:先将众多探针集成于一张芯片上;从血清样本中提取的病毒DNA经体外扩增后,与芯片探针杂交;再 据杂交信号应用计算机软件自动判读HBV变异情况。该方法具有快速、高效、敏感、平行化、自动化等优点,但因成本昂贵,目前尚难以应用于临床常规检测工作。

七、基因序列测定

   以往因为基因序列测定过程复杂、成本高,未能用于临床检测。随着自动测序仪器的普及和PCR产物直接测序技术的成熟,目前该技术已日趋简便、稳定,可准确测序600~800bp,试剂成本亦已大幅度下降,故而现已具备应用于临床检测的条件。在美国,基于该技术的HIV耐药变异检测系统已经FDA批准用于临床检测。

目前已知的针对核苷类药物的HBV耐药变异位点均集中于HBV逆转录酶A~E区,全长549bp,所以应用PCR产物直接测序技术检测HBV耐药变异不仅可通过一次实验检测全部已知耐药变异位点,而且尚能了解HBV逆转录酶其他位点的变异情况,有助于发现新的耐药变异位点。如能在此基础上,建立HBV基因耐药数据库并编制专用基因序列分析软件,对测序结果进行自动化分析,则有望开发商品化的临床检测试剂盒。

 

第五节         表型耐药检测技术简介

耐药变异株的初筛主要通过对临床耐药患者体内HBV DNA变异情况进行分析从而发现新的基因型耐药变异。但由于方法学的误差、非保守位点突变、准种的存在等因素的影响,耐药变异株的最终鉴定尚需在可控性良好的体外实验模型上进行药效学实验,以验证初筛所获变异株对核苷(酸)类似物的敏感性,即明确是否存在表型耐药。

HBV具有高度的种属和组织特异性,仅仅对人和类人猿具有感染性。体外培养的人和类人猿原代肝细胞可以支持HBV的复制,但细胞维持时间不长。因此目前多选择能在体外体外长期培养的肝源性肿瘤细胞株构建细胞模型,如HepG2Huh6Huh7等。

为克服HBV难以感染肝源性肿瘤细胞株的所谓细胞膜屏障,可借用其他病毒的感染能力,把HBV导入到靶细胞内;目前常用于表型耐药检测的HBV药物体外筛选系统有两种。其一为HBV-杆状病毒系统:利用杆状病毒将具有复制能力的HBV基因组导入到HepG2Huh7细胞,检测到高水平的HBV表达,包括细胞内和细胞外HBV DNARNA,以及cccDNA和各种HBV抗原。病毒表达的水平和病毒的感染量(MOI)有量效关系。该系统可以控制感染的时间,在病毒复制期间或之前对细胞进行处理。用该系统对拉米夫定的药效进行评价,发现拉米夫定可以减少细胞内复制中间体和细胞外HBV DNA,而且可以抑制cccDNA的表达,这在以前的系统中是不能观察到的。国外已有应用此模型进行HBV变异株对核苷类药物敏感性实验的报道。但是,杆状病毒系统也有缺陷:(1) 杆状病毒进入哺乳动物细胞是通过非特异的内涵体摄取而不是受体介导方式,每个细胞内有多个HBV拷贝;(2)杆状病毒介导的基因转移限制在一定的种属,不能作为动物体内实验的方法。另一为Ad-HBV1.3系统,以腺病毒(adenovirusAd为载体,将1.3倍的HBV转入包装细胞,再将包装好的病毒感染HepG2Huh7细胞,可以产生高水平的HBV表达。该系统利用细菌内同源重组法将具有同源性的两个质粒pAdEasypAdTrack-CMV共转化E.coliBJ5183细胞,使腺病毒载体和目的基因HBV1.3连为一体。HBV1.3除含完整HBV基因组外,在5′端还多余一段HBV序列,即ENHIENHII。转基因小鼠实验证实HBV1.3HBV1.1HBV1.2更高地表达HBVSprinzl等利用AdHBV1.3,将293细胞包装好的病毒感染数种原代肝细胞和HepG2细胞,获得成功。分别用Ad-HBV1.3感染人原代肝细胞,小鼠肝细胞,大鼠肝细胞,树鼩肝细胞,以及鸭肝细胞和HepG2细胞,应用Southern杂交检测出细胞内HBV DNAcccDNA,northern杂交检测到3.5kb2.4kb2.1kbHBV RNA。用western blot 检测到HBV各种抗原。应用斑点杂交方法检测到培养基或血清中的HBV颗粒。该系统使HBV可以感染跨种的多种细胞,包括小鼠,大鼠,树鼩肝细胞,甚至包括禽类的鸭肝细胞。以DHBV代替HBV也能得到相似的结果。该系统具有高效转移、表达HBV,可对HBV突变和表达进行人为控制等优点;和杆状病毒系统相比,它不存在种属障碍,可以用做体内实验,而且表达水平更高。

待检测HBV变异株导入肝源性肿瘤细胞系后,将不同浓度的核苷(酸)类似物加入细胞培养液中,经过一定培养时间后检测细胞培养液中的HBV DNA载量,同野生株相比较即可得出半数有效浓度(50% effective concentrationEC50)或半数抑制浓度(50% inhibiting concentrationIC50),用以评价耐药程度的高低。

第六节         HBV耐药变异的相关临床问题

一、HBV耐药变异的临床表现

HBV耐药变异的临床过程可分为三个阶段:应答阶段、基因型耐药和临床耐药。采用核苷(酸)类似物治疗后HBV DNA迅速下降,继之ALT亦下降,此为应答阶段;此后在药物选择性作用下,野毒株得到了控制,而突变株逐渐成为优势株,此时用敏感的方法可以检测到突变株,但无明显临床表现,为基因型耐药阶段;继之血清HBV DNA水平出现突破和反跳,而后ALT水平突破和反弹,称为临床耐药。

耐药变异的出现会影响CHB患者的预后。多项研究表明采用LAM治疗的CHB患者出现病毒学突发后,不同个体的临床表现轻重不一,部分患者表现为静默状态(silent),无明显肝脏损害,部分患者可出现ALT的上升,呈肝炎的再发作(rebound),少数患者可引起急剧病情恶化(exacebation)导致肝衰竭。一项LAM两年临床研究结果表明,YMDD变异对疾病具有明显影响,58%出现YMDD变异的患者中55%出现ALT增高,24%病情迅速恶化,但治疗后临床均好转;已获应答者HBeAg转换率减少,已获得的肝组织学改善可趋向恶化,。对肝移植患者,一旦出现LAM耐药,疾病迅速进展,可使肝移植失败甚至死亡。

二、HBV耐药变异的早期预测因素

    开始核苷(酸)类似物治疗前或治疗过程中如能早期评估病人出现耐药的可能性和风险, 从而预测耐药变异的产生,将有利于提高HBV抗病毒治疗的效果,减少耐药变异的发生。

随着LAM应用时间的延长,陆续有报道认为一些因素可作为预测YMDD变异产生的指标。有国外研究发现治疗前ALT超过3倍正常值、HBeAg阳性、HBV DNA水平高于1495Meq/ml以及接受过泛昔洛韦治疗的病人容易发生耐药。侯金林等对247例接受拉米夫定治疗的慢性乙型肝炎患者进行随访后发现,治疗前HBeAg阳性和HBV DNA超过7.5×106 拷贝/ml者发生YMDD变异的可能性较高,治疗前HBeAg阳性的患者YMDD变异出现较早。香港的一项研究对159例拉米夫定治疗患者进行随访研究(平均随访时间30个月),发现如果患者接受拉米夫定治疗6个月时HBV DNA水平仍高于103拷贝/ml,随访结束时发生YMDD变异的可能性为62.3%,而治疗6个月时HBV DNA水平低于103拷贝/ml者,随访结束时发生YMDD变异的可能性仅为13%。我们对313例应用LAM治疗的慢性HBV感染者(其中包括249例CHB和64例 LC)进行长期随访,并通过时序检验及Cox回归分析等方法探寻LAM耐药变异的早期预测因子,发现:未联合干扰素治疗、基线ALT水平较低、 HBV DNA水平较高和治疗前已确诊肝硬化均与YMDD变异的较早出现有关。

Locarnini报告ADV治疗一年时70%病人HBV DNA水平小于103copies/mL,30% 患者病毒载量大于103copies/mL。治疗144周后前者中有4例(5%)发生耐药,后者中有34例(30%)发生耐药。由此可认为,ADV治疗一年时HBV DNA水平可以预测3年时ADV耐药发生的情况。

一项随机、开放、多中心IIIb期研究表明,LdT治疗24周时的HBV DNA水平可作为疗效的早期预测指征,早期抑制病毒越强,远期疗效越好; 据24周时的HBV DNA水平可发现耐药高风险的患者,通过及时调整治疗方案以预防并最终降低耐药的发生。

三、HBV耐药变异的临床处理

出现病毒耐药后通常有以下处理方法:停止目前治疗、继续目前治疗、加用另一种抗病毒药物、改用另一种抗病毒药物。目前认为停止目前治疗和继续目前治疗均有可能引起肝炎急性加重,甚至发生肝脏失代偿,不宜采用。

随着新药物的不断上市,对LAM耐药患者的处理,已有了长足的进步;目前可以选用ADV、ETV或干扰素α/聚乙二醇化干扰素α继续治疗。

最近有研究比较了ADV的不同应用时机(出现基因型耐药时VS出现临床耐药时)对LAM耐药的HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者者预后的影响,结果显示:为达到抗病毒治疗效果最大化,ADV应在检测到基因型耐药时便开始应用,而不应等待临床耐药的出现。

早期的研究表明,如果出现拉米夫定耐药,拉米夫定与阿德福韦酯重叠用药1~3个月后停用拉米夫定,与拉米夫定联合阿德福韦酯的临床疗效没有差别,但18个月以后,两药联合治疗的方案就显示出优势:更好的疗效,更低的针对阿德福韦酯的耐药。因此,更多的临床资料表明拉米夫定联合阿德福韦酯的方案对于长期抗病毒治疗来说可能更为合理。

体外实验及临床试验均显示ETV与LAM有部分交叉耐药,并且目前已有符合循证医学原则的临床试验数据表明:对于已经发生LAM耐药的慢性乙型肝炎患者而言,改用ETV 1.0mg/d,其长期疗效不及加用ADV。因此对于LAM耐药患者的处理,目前多主张在LAM基础上加用ADV。

   目前尚无干扰素α/聚乙二醇化干扰素α治疗LAM失败/耐药患者的随机对照研究结果发表。在2006年亚太地区肝病年会上Piratvisuth报告了一项名为PEGaLAM的回顾性研究,结果显示聚乙二醇化干扰素α-2a (40KD) (PEGasys)对核苷(酸)类似物治疗失败的慢性乙型肝炎的疗效并不比聚乙二醇化干扰素α初治患者差。

   ADV耐药变异病毒株rtN236T和rtA181V有不同的交叉耐药性。体外实验显示,rtN236T变异病毒株对LAM、LdT、和ETV的敏感性没有明显变化,对TDF及克拉夫定的敏感性也仅降低4~5倍。在临床上,LAM和TDF对rtN236T变异病毒株均显示很好的抑制效果。与rtN236T变异病毒株不同,rtA181V变异病毒株对大部分抗HBV核苷类药物均呈现一定程度的耐药性。在体外实验中,rtA181V病毒株对LAM、ETV和恩曲他滨的敏感性降低12~15倍。当接受ADV治疗患者产生rtA181V变异后,改用或加用LAM能使HBV DNA降低2~3个log10拷贝数/毫升,但并不能完全抑制HBV复制。相对于其它核苷类药物,在体外试验中rtA181V病毒株对TDF敏感度变化最少,但TDF在临床治疗中抑制rtA181V病毒株的效果尚不清楚。

   ETV耐药病毒均含有YMDD变异,由于YMDD变异病毒对L构型核苷类药物有很强的耐药性,LAM、LdT、恩曲他滨及克拉夫定不能起到抑制ETV耐药病毒株的作用。值得庆幸的是,ETV耐药病毒株仍然对ADV敏感,故而对ETV耐药患者可考虑使用ADV。

随着越来越多的HBV感染者接受多种核苷(酸)类似物治疗,预计广谱耐药HBV病毒株迟早将会出现。预防耐药变异的重点在于全面抑制HBV复制,因为病毒停止复制,突变就无从产生。故而选用抑制HBV能力强、耐药发生率低的药物并坚持每天不间断服药应可降低耐药病毒产生的机会。

联合用药在延缓及降低耐药性产生方面明显优于单一治疗,这一观点早已在艾滋病治疗方面成为主流。但在慢性HBV感染治疗上,联合用药尚处于探索阶段。目前既无联合治疗指南推荐于临床,也无大样本、多中心的随机、对照研究结果可以参考;故而联合用药是否会成为一种趋势还有待观察。

 

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