一
症状
HSV感染是一种全身性疾病
病毒经呼吸道口腔生殖器粘膜或破损皮肤进入人体可潜于人体正常粘膜血液唾液以及局部感觉神经节和多数器官内几乎所有的内脏和粘膜表皮内都可分离到HSV
原发感染多为隐性大多无临床症状或呈亚临床表现仅有少数(约1-10%)可以出现临床症状主要见于免疫功能低下婴幼儿或严重营养不良或有其它感染的儿童成人罕见原发感染消退后病毒可持续潜居体内正常人中约有半数以上为本病毒的携带者可通过口鼻分泌物而成为传染源由于HSV在人体中不产生永久免疫力故每当机体抗病能力减退时如患某种发热性传染病胃肠功能紊乱月经妊娠病灶感染过度疲劳情绪环境改变时体内潜伏的HSV即被激发而发病
HSV-1主要引起口唇疱疹咽炎角膜结膜炎和散发性脑炎而HSV-2感染主要引起生殖器疱疹但在临床上也有相反情况
HSV感染的潜伏期为1-45天平均为6天HSV-1感染主要发生于口角唇缘鼻孔等皮肤粘膜交界处亦可见颜面或口唇开始局部先有灼痒及轻度紧张感偶有伴发神经痛随即出现红斑在红斑基础上发生簇集性小丘疹迅速变为粟粒至绿豆大小的水疱内容澄清水疱破裂后出现糜烂面数日后干燥结痂自觉灼痒偶有倦怠不适和轻微发热等全身症状愈合可遗留暂时性色素沉着全病程1-2周左右
HSV-2感染主要发生于生殖器部位患部先有烧灼感很快在红斑的基础上发生成群的小水疱多见男性包皮龟头冠状沟阴茎等处偶见于尿道；女性常见于阴唇阴蒂阴道宫颈等处水疱可逐渐变成脓疱约6天左右破溃而形成糜烂或浅的溃疡自觉疼痛病人可发生尿道炎出现排尿困难多数人有腹股沟淋巴结肿大疼痛有的病人可出现发热肌肉痛及脑膜炎症状如发于女性宫颈者可形成溃疡坏死阴道分泌物增多可有下腹痛应注意有无宫颈癌发生孕期患生殖器疱疹时易致流产早产或死胎并易使新生儿感染发生新生儿单纯疱疹本病一般经过3周左右可以痊愈但常有反复发作一般原发疹后1-4个月内复发症状较原发者轻范围亦小局限于生殖器部位有时仅有1-2个疱疹病程亦短自发病至愈合8-12天本病也可伴有生殖器以外部位的感染如口唇臂部及中枢神经系统等
二体征
皮损为红斑基础上可见成群的水疱或脓疱或成糜烂及溃疡女性患者约90%伴有HSV宫颈炎宫颈可见发红糜烂溃疡有脓性阴道分泌物有的患者可有腹股沟淋巴结肿大压痛或体温升高皮肤病变也可出现在口唇 手指臀部大腿手臂甚至眼部与咽喉并发脑膜炎或横贯性脊髓炎一般于发疹后3-12天出现颈项强直等颅内压增高的现象
三潜伏感染和复发
HSV感染人体后1周左右血中出现中和抗体3-4周达高峰可持续多年这些抗体能清除病毒和使机体康复但大多数个体不能彻底消灭病毒也不能阻止复发病毒以潜伏状态长期存在宿主体内不同亚型HSV感染者急性首发生殖器疱疹的临床过程相似但生殖器病变复发率不同首发HSV-2感染者约90%在12个月内会出现一次复发(平均复发4次)而初次感染HSV-1者仅50%出现类似复发(平均复发次数小于1)不同个体及同一病人一生中生殖器HSV-2感染的复发率变化很大大多数年复发5-9次一般在原发疱疹消退后1-4个月内发生有些患者受到促发因素如发热月经日晒寒冷某些病毒感染等的影响而复发其特点是每次复发往往发生在同一部位复发前可有前驱症状如局部瘙痒发疹前数小时感染部位有灼烧麻刺感
复发生殖器疱疹(GH)对患者心理影响较大由于目前尚无预防复发的有效疗法及可能有诱发生殖器恶变的危险性故给患者带来心理影响患者多有抑郁恐惧等心理障碍这又直接影响HSV的复发我们的治疗经验只要患者坚持规律治疗都能治愈
四HSV与HIV感染：
HSV常与HIV-1同时感染并能促进病情发展引起严重的局部和播散性感染目前认为HSV是一种调节因素能激活HIV复制Heng对6例AIDS合并生殖系统HSV皮肤损害患者进行皮肤活检发现角化细胞和巨噬细胞均有HIV-1和HSV-1杂交后使HIV-1保留其感染性而无需与CD4分子结合即能进入细胞内此外HSV-1能刺激潜伏型HIV-1而增加HIV-1/HSV-1共同感染和在组织中的复制
表皮细胞发生气球样变性其中可见有嗜酸性包涵体表皮开始为网状变性形成的多房性水疱以后聚合为单房性水疱真皮乳头层有轻度水肿有轻重不等炎性细胞浸润反应严重时可有严重血管炎表现
HSV感染的诊断要依据病史临床表现和实验室检查结果而定有不洁性交史而且在生殖器部位出现皮肤红斑和原发性水疱易复发等不难诊断必要时可作疱液涂片培养接种免疫荧光检查血清免疫抗体测定等均有助于诊断和确定病毒类型
一细胞学方法
对皮损刮片做Wright-Gemsa (Tzanck试验)或Papanicolaou染色可检出HSV感染特征的巨细胞包函体但不能区别HSV感染或水痘 — 带状疱疹病毒感染敏感性仅为病毒分离的60%
二培养法
从水疱底部取材做组织培养分离病毒为目前较敏感最特异的检查方法需5-10天因其技术条件要求高价格昂贵不能普遍使用
三抗体检测
目前最广泛的是HSV-2抗体检测如蛋白印迹法也可用gD2作抗原检测HSV-2抗体具有敏感性且能区分HSV-1和HSV-2的优点
四基因诊断
(一)用PCR分型检测单纯疱疹病毒
PCR是一种敏感性高特异性强的快速检测方法标本中含有1fg HSV-DNA就可以检出其在HSV感染的诊断研究中发展较快且分型检测HSV是发展的趋势
1标本采集和处理
(1)标本采集
①脑脊液：直接无菌采取患者0.5ml脑脊液标本于无菌试管送检.如肉眼可见血色应离心取上清
②羊水及婴儿血清: 同上应避免溶血.
③脑组织: 脑组织尸检活检标本 加1ml PBS标本缓冲液研磨后待检
④眼及皮肤病灶分泌物：用预测(半干)棉拭子直接取患处分泌物 置1ml PBS标本缓冲液中送检
⑤生殖器(宫颈阴道外阴阴茎)标本：先用消毒棉拭子擦去病变部位表面粘液污垢再用预潮棉拭子用力擦拭患处分泌物置1ml PBS标本缓冲液中送检
(2)标本处理
①预处理：所有液体标本均可直接进行模板制备；可以取100μl标本液离心5000 r/ min×5min后去上清取沉淀物进行模板制备
②模板制备：a: 蛋白酶K消化裂解法：沉淀物加100μl蛋白酶K消化裂解液55℃1 h后煮沸10 min离心5000 r/ min×5min收集上清 b: 水煮法：沉淀物加100μl蒸馏水摇均水煮20 min离心5000 r/ min×5min收集上清c: 1%Triton X-100裂解法:取采集的标本液100μl加入1μl Triton X-100水煮20 min5000 r/ min×5min收集上清d: 5%NP-40裂解法：取采集的标本液100μl加5μl NP-40水煮20 min 5000 r/ min×5min收集上清e: 如标本溶血严重经上述裂解处理后再加等体积酚-氯仿抽提冷乙醇沉淀DNA加10μl DW溶解待检
2PCR扩增
(1)引物设计以HSV DNA聚合酶的高保守区为检测靶序列以确保特异性设计3个引物一个上游共同性引物DNAP5(5′ATGGTGAAAACATCGACATGTACGG3′)：二个下游特异性引物DNAP3-1(5′CCTCGCGTTCGTCCTCGTCCTCC3′ )和DNAP3-2(5′CCTCCTTGTCGAGGCCCCGAAAC3′)可以分别扩增出HSV-1 469bp DNA片段(1981～2359)HSV-2 391bp片段(1561～1953)：从二型PCR扩增产物中设计了一个不分型的特异性探针HSVP3 5 ‘GGCGTAGTAGGCGGGGATGTCGCG 3‘)
(2)PCR实验体系取模板10μl： DNAP5 0.5(0.2μmol/L)：DNAP3-1 0.5μl (0.2μmol/L)：DNAP3-2 0.5μl (0.2μmol/L)：4×dNTP 8μl(4×200μmol/L)：10×dNTP 8μl(4×200μmol/L)；10×缓冲液10μl：DMSO 4μl；加DW 65.5μl； 石蜡油 30μl.
水煮(96℃～100℃)7min
加TaqDNA聚合酶1μl；(2.5U)
72℃4 min
↓
95℃40s
↓
65℃60s → 72℃70s
↓ 33个循环
70℃4 min
3.扩增产物的检测和分析
(1)琼脂糖凝胶电泳染色法：取扩增产物20μl加样品缓冲液4μl混匀后点样于2%琼脂糖凝胶板70V电泳15～20min溴化乙锭(EB)染色5min于紫外灯下观察结果在溴酚蓝后面有一条或二条亮红带为阳性结果HSV-2带在前HSV-1带在后无带则为阴性结果
(2)XhoI酶谱法：取HSV-1型PCR产物50μl加XhoI50U37℃1h后置3%琼脂糖凝胶中70V电泳15～20min可产生46bp片段带(引物后面)；与正常PCR产物比较XhoI酶切后的大片段电泳位置前移
(3)Southern印迹法：PCR产物20μl经电泳分离后用变性液处理60min再用中和液处理90 min转移至硝酸纤维素膜上：80℃烤膜2 h42℃预杂交(杂交液中)30 min 加入32p标记HSVP3探针后42℃杂交过夜；次日用1%SDS/ PBS pH7.2 42℃洗15min 0.5% SDS/PBS pH7.2 42℃洗15min； 膜置X线暗盒内放射性自显影12～15h 显影为阳性 不显影为阴性
(二)套式PCR
套式PCR(nested primers-polymerase chain reactionNP-PCR)是通过“外侧”“内侧”两对引物即一对扩增较大DNA片段的“外侧”引物和一对位于扩增产物中再扩增小片段的“内侧”引物这样两次连续放大可以提高PCR检测的灵敏度保证产物的特异性但该方法不能分型能100%检出HSV-150%检出HSV-2应改进分型检测HSV更好地在临床应用和基础研究中推广应用
1标本处理：
(1)标本采集同上
(2)DNA 制备：①脑脊液：取100μlCSF 水煮15min加入250μl无水乙醇放-30℃10 min；离心10000g30 min去上清30℃干燥后加入10μl DW； ②脑组织细胞：取沉淀物加100μl蛋白酶K消化裂解液56℃作用1h水煮10 min；取上清加入等体积酚一氯仿(V/V)轻摇10 min离心10000r/ min×10 min；取水相加入250μl DW溶解
2PCR扩增
(1)引物设计：选择HSV1糖蛋白D基因为检测靶基因
NP-PCR 的引物和探针序列
“外”引物
BJHSV1.1ATCACGGTAGCCCGGCCGTGTGACA19-43
BJHGV1.2CATACCGGAACGCACCACACAA218-239
“内引物”
BJHSV1.3CCATACCGACCACACCGACGA51-79
BJHSV1.4CGTAGTTGGTCGTTCGCGCTGAA166-188
探针
BJHSV-1PROTACGAGGAGGAGCTGTATAACAAAGTCTGT96-125
(2) PCR实验体系和程序: 反应体积为50μl；模板10μl；BJHSV1.1 0.5μl(0.2pmol/L)； BJHSV1.2 0.5μl(0.2pmol/L)； 10×缓冲液5μl； 4×dNTP 4μl(4×200mmol/L)；DW 27μl； 石蜡油30μl循环参数为95℃30s； 55℃30s； 72℃60s； 循环20次 取其扩增产物1μl加入含有BJHSV1.3和BJHSV1.4反应体系中进行套式扩增 先95℃变性2min循环参数为95℃30s； 55℃30s； 72℃60s； 循环30次后72℃延伸5 min；
(3) 扩增产物分析：
① 琼脂糖凝胶电泳染色法：
取扩增产物10μl点样于2%琼脂糖凝胶中 70V电泳15-20min溴化乙锭染色5min于紫外灯下观察结果在溴酚兰后面有一条或二条亮红条带为阳性结果 HSV-2带在前HSV-1带在后无带则为阴性结果
② Southern印迹法：
PCR产物20μl 经电泳分离后用变性液处理60min再用中和液处理90min转移至硝酸纤维素膜上80℃烤膜2h42℃预杂交(杂交液中)30min加入32P标记HSV探针后42℃杂交过夜次日用1%SDS/PBS pH7242℃洗15min0.5%SDS/PBS pH7.242℃洗15min；膜置X线暗盒内放射性自显影12-15h显影为阳性不显影为阴性
(三)聚合酶链反应—酶谱法(polymerase chain reaction-endonuclease cleavage PCR-EC)
具有经济广泛等特点；不仅能一次性分型检测HSV-1HSV-2EBVCMV四种病毒而且方法本身快速方便无放射线损伤易被实验室接受可检出3个CFU的HSV1灵敏度高能检测出中枢神经系统感染第1dCSF中HSV DNA阳性结果并可用于药物治疗效果的评价由于病毒的变异性会出现酶切点突变丢失现象从而造成酶切阴性结果对此可以通过型特异性探针或序列分析解决
1. 标本处理
(1)标本采集方法同上
(2)DNA模板制备：每份标本取200μl按200μg/ml加入蛋白酶k56℃作用1h；
加入等体积的酚—氯仿(v/v)轻摇10min离心1000r/min×5min；取水相加入500μl(2.5倍体积)无水乙醇-20℃过夜沉淀DNA离心15000r/min×5min吸去液体30℃干燥后加蒸馏水25μl溶解 待检
2. 引物设计：
P15′CGACTTTGCCAGCCTGTACC3′
P25′AGTCCGTGTCCCCGTAGATG3′
(1)PCR实验体系：
反应体积100μl； 模板10μl ； P1 0.5μl(10pmol/L) P2 0.5μl(10pmol/L)； 4×dNTP 4μl(4×200mmol/L)； 10×缓冲液10μl DMSD 5μl DW 65μl 循环参数为94℃60s； 60℃60s； 72℃60s；循环40次72℃延伸4min
(2)扩增产物检测与酶切分型.
①第一步电泳鉴定: 取10μlPCR产物加4μl样品缓冲液加入2%琼脂糖凝胶板70V电泳(5-20min)加EB染色5min后紫外灯下观察可初步鉴定扩增产物大小
②酶切分析：分别取20μlPCR产物于2个Eppendorf管中加入50μl无水乙醇-20℃沉淀DNA再分别用20μlSmal和BamHI反应缓冲液溶解加入SmaI或BamHI 50U于相应Eppendorf 管内37℃作用1h
③第二步电泳分型取10μlPCR酶切物加4μl样品缓冲液加到2%琼脂糖凝胶中70V电泳15-20min后 EB染色5min与同步加入未酶切的PCR产物相对照 紫外灯下观察 结果如下:
PCR-EC法检测四种病毒结果
病毒型号靶片段SmaIBamHI
HSV1518bp476bp+42bp
HSV2518bp—225+293bp
EBV524bp100bp+424bp277bp+247bp
CMV589bp不需酶切第一步电泳就可以区分
(四)用RT-PCR检测单纯疱疹病毒
RNA的聚合酶链反应(RNA-PCR)可能通过检测HSV不同期的RNA这不仅可诊断HSV感染而且有利于HSV的潜伏期感染机制的深入研究
RT-PCR是以RNA为模板经逆转录反应(RT)产生cDNA再以cDNA为模板进行PCR扩增以达到检测目的因此RNA-PCR也可称为RT-PCR
1标本处理：
组织块细胞总RNA提取取100mg组织标本加1ml硫氰酸胍变性液于匀浆器中室温研磨均匀后移入2.5mlEppendorf 管中依次加入0.1ml3mol/L(pH4.0)NaAc 1ml水饱和酚和0.2ml氯仿一异戊醇混匀 用力振摇10s 置冰浴15min10000g4℃离心20min取上清水相(上层DNA下层DNA和变性蛋白质)加入等体积异丙醇置-20℃1h 沉淀RNA离心 15000r/min×10min弃上清 RNA重新用0.3ml硫氰酸胍变性液溶解 再加0.3ml异丙醇沉淀 -20℃1h 沉淀RNA. 离心15000r/min×10min 去上清 沉淀RNA用75%冷乙醇洗一次 真空干燥.加10μl TE缓冲液(pH7.4)溶解低温保存备用.临用前冰浴溶解
2PCR扩增:
(1)引物设计: 选择HSV-1ICPO基因(极早期)为检测靶基因.设计2个引物
P1 5′GGATCCTCACGTGGTTACCCGCGGTCT 3′
P2 5′AAGCTTCCGGGGCCGTCCCCGCGGGCG 3′可以扩增ICPO 中266bp序列
1个探针：5′CCGGCTGGAGCCGCCGCACCCTGCT3′
(2)PCR实验体系： 总反应体积为50μl模板10μl (0.25-1.0μg)P1 1μl (20pmol/L)；P2 1μl (20pmol/L)； 4×dNTP 4μl(200μmol/L)； 10×缓冲液5μl； AMV(逆转录酶) 2μl (50U)； DW 26μl； 循环参数 94℃变性2min后 94℃50s60℃60 72℃60s循环40次后72℃延伸5min
3扩增产物的鉴定：
(1)琼脂糖凝胶电泳染色法：取10μl PCR扩增产物加4μl 样品缓冲液混匀后加样2%琼脂糖凝胶板70V电泳15-20minEB染色5min紫外灯下观察扩增条带
(2)Southern印迹杂交法：用32P标记的特异性探针检测PCR产物方法同上
总之在HSV感染性疾病的临床诊断中PCR能对前病毒或潜伏期低复制的HSV特异性靶DNA片段进行扩增检测远较DNA探针敏感并能在血清中抗体出现前就可以检出因此PCR无论是作为基础研究手段还是作为临床检验诊断方法均具有广阔的前景
五病理组织学诊断
细胞内水肿基底层形成大水疱病灶周围有多核巨细胞浸润特别是多核白细胞与淋巴细胞充斥于病灶中间
