脑脊液单克隆抗体检测癌细胞

　　MCAb具有单一性好，特异性强，纯度高和重复性好等特点。

单克隆抗体技术可鉴定恶性细胞的组织来源，有助于癌性脑膜病的早期诊断。脑脊液中恶性细胞有癌细胞、神经外胚层瘤细胞和淋巴瘤细胞。其检测阳性率可达60%。

（1）直接荧光抗体法：　　①抗原基质片（活检组织冰冻切片，被检物直接涂片，培养物涂片等），经无水乙醇或丙酮、甲醇等（要根据实验要求选择固定剂）固定处理后室温晾干。　　②加荧光标记同属类特异性抗体于基质片上，放湿盒置室温或37℃温箱反应30min～1h。　　③0.01mol/L pH7.2 PBS缓冲液冲洗15min（换3次PBS）。　　④pH7.2或pH7.4缓冲甘油封片。　　⑤荧光显微镜镜检。　　

（2）间接荧光抗体法：　　①抗原（或抗体）基质片（各种组织冰冻切片或培养细胞等）基质片从冰箱取出立即风干。使用前经无水乙醇或丙酮、甲醇等固定剂处理（根据实验要求选择固定剂），一般固定3～15min，室温晾干。　　②被检物（血清、脑脊液或其他渗出物等），根据需要用PBS适当稀释（1∶5或1∶10）滴于抗原基质片上，置室温或37℃温箱反应30min～1h。　　③0.01mol/L pH7.2 PBS冲洗15min（更换PBS 3次）。　　④加荧光标记抗体，置室温或37℃温箱30min～1h。　　⑤PBS冲洗同③。　　⑥缓冲甘油（pH7.2）封片，荧光显微镜镜检。　　

（3）补体法：　　①抗原基质片（组织冰冻切片或培养细胞），从冰箱取出立即风干，经无水乙醇或丙酮、甲醇固定3～15min，室温晾干。　　②被检物（血清或其他），实验前置56℃水浴中30min灭活，冷却后用PBS根据实验要求适当稀释（1∶5或1∶10）。　　③将上述灭活稀释被检物与新鲜豚鼠血清（生理盐水1∶10稀释）或新鲜正常人血清进行等量混合，滴加在基质片上。置室温或37℃温箱反应30min。　　④PBS冲洗同（2）-③。　　⑤滴加荧光标记抗补体抗体于基质片上置室温或37℃温箱反应30min。　　⑥PBS冲洗同④。　　⑦缓冲甘油封片，镜检同（2）-⑥。　　

（4）双层法、加层法、混合法、补体法，可根据原理示意图，用上述基本法操作即可。　　

（5）双重染色法：用于同时示踪两种抗体或抗原，其操作方法同上，只是荧光标记物用两种荧光素标记，一般用异硫氰酸荧光黄（FITC）发黄绿色荧光，另一种是罗丹明B200（RB200）发橙红色荧光，两种标记物可混合应用，也可先后分别应用，在紫外光下可同时被激发，在同一部位发出各自特异标记荧光。　　

（6）反衬染色法：在上述荧光染色镜检中，为加强特异荧光与背景的对比度。常用反衬染色的方法，来消除背景荧光，突出特异荧光。常用于反衬染色试剂。有RB200、FITC分别做特异的和非特异的标记，二者混合间接荧光染色法染色以达到特异和非特异反衬目的。另一种试剂是伊文思蓝（Evan blue）它发射与RB200类似的橙红色荧光。使用方法可将FITC荧光染色的标本片，浸入1∶1 000～1∶10000稀释的伊文思蓝溶液中2～5min，取出后用PBS冲洗10min，封片镜检。也可将伊文思蓝以适当的比例与荧光标记抗体溶液混合染色，镜检中可观察到明显衬出FITC黄绿色特异荧光。